Export ???item.export.type.endnote??? ???item.export.type.bibtex???

Please use this identifier to cite or link to this item: https://bdtd.ucb.br:8443/jspui/handle/tede/2259
Type: Dissertação
Title: Expressão e purificação do alvo molecular Rim8 visando o desenvolvimento de novas drogas antifúngicas
Author(s): Vieira, Lucas Luiz 
First Advisor: Felipe, Maria Sueli Soares
First co-advisor: Abadio, Ana Karina Rodrigues
Summary: Infecções fúngicas invasivas são um problema de saúde pública no mundo, já que aumentam a morbidade e o tempo de internação de pacientes. A micose sistêmica com o maior índice de mortalidade no Brasil, onde é considerada endêmica, é a paracoccidioidomicose, causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides spp. A tendência global de aumento da resistência aos agentes antifúngicos disponíveis comercialmente, o espectro limitado de atividade contra alguns fungos patogênicos e a preocupação com a toxicidade são evidências da necessidade de novas estratégias terapêuticas, sobretudo do desenvolvimento de novas drogas antifúngicas. Nesse sentido, o gene essencial rim8 foi identificado por genômica comparativa como uma sequência ortóloga no genoma de fungos patogênicos humanos e ausente em humanos. Em fungos filamentosos e leveduras, a regulação da expressão gênica pelo pH envolve componentes de uma via de sinalização que levam à ativação proteolítica do fator de transcrição PacC/Rim101 em resposta à alcalinização do pH externo. O gene rim8 em leveduras ou palF em fungos filamentosos possui um papel essencial nessa cascata de sinalização, sendo importante para a interação patógeno-hospedeiro, aumento de virulência e sobrevivência do patógeno. Por isso, Rim8 é um alvo molecular promissor e bastante interessante para o desenvolvimento de drogas. O objetivo deste trabalho é otimizar a expressão heteróloga e purificação da proteína Rim8 de P. lutzii, visando realizar a caracterização estrutural e funcional da proteína para futuramente utilizá-la como alvo molecular para o desenvolvimento de drogas. O gene rim8 foi sintetizado quimicamente com cauda de histidinas e foi clonado em vetor pET-21a. A expressão heteróloga do gene foi padronizada usando duas estirpes de E. coli, obtendo as melhores condições para purificação com o uso de meio LB contendo 0,5% de glicose a 30°C por 2 h e 0,25 mM de IPTG e coquetel de inibidores de proteases. Os resultados da expressão e purificação foram analisados por SDS-PAGE e/ou confirmados por western blot. Realizou-se a imunização de camundongos BALB/c com a proteína purificada para obtenção de anticorpos anti-Rim8. A produção dos anticorpos foi confirmada por ELISA. A imunocitolocalização em células de P. lutzii mostrou que a proteína se encontra associada à membrana plasmática de forma difusa em pH ácido, em seguida apresenta focos localizados em resposta a um pH próximo da neutralidade e, por fim, migra para o interior da célula em pH alcalino. Sendo assim, pode-se inferir que o trabalho apresenta contribuições para o desenvolvimento de novas drogas antifúngicas, além de auxiliar o entendimento do processo biológico no qual a proteína RIM8 está envolvida.
Abstract: Invasive fungal infections are a major public health problem in the world, since they increase morbidity and patients’ hospitalization time. In Brazil, the highest mortality rate among the systemic mycoses is caused by an endemic disease named paracoccidioimycosis, which the etiologic agent is the dimorphic fungus Paracoccidioides spp. The worldwide increased resistance to the commercially available antifungal agents, their limited spectrum of activity against some fungal pathogens and concerns with their toxic side effects are reasonable evidence of the necessity of novel therapeutic strategies, especially the development of new antifungal agents. Thus, the essential gene rim8 was identified by comparative genomics as an orthologous sequence in the genome of human pathogenic fungi absent in the human genome. In filamentous fungi and yeasts, gene expression regulation by the ambient pH involves components of a signaling pathway that mediate proteolytic activation of the transcription factor PacC/Rim101 in response to alkaline environmental pH. The rim8 gene in yeasts, also called palF in filamentous fungi, performs an essential step in this signaling pathway. It is important for host-pathogen interaction, leading to increased virulence and pathogen survival. Thus, Rim8 is a very interesting and promising drug target. The aim of this work is to optimize heterologous expression and purification of Rim8 protein from P. luzii to further perform its structural and functional characterization and also, to use it as a molecular target for drugs development. The rim8 gene was chemically synthesized with a histidine tag and cloned into a pET-21a vector. Heterologous expression of the gene was made using two strains of E. coli, obtaining the best conditions using LB medium with 0.5% glucose at 30 °C for 2 hours and 0.25 mM IPTG and adding protease inhibitor cocktail. The Rim8 heterologous protein was purified using a nickel affinity chromatography column. Expression and purification results were analyzed by SDS-PAGE and in some cases, confirmed by western blot. Immunization of BALB/c mice was performed with the purified protein to obtain anti- Rim8 antibodies. The antibody production was confirmed by ELISA test. The protein immunocitolocalization in P. lutzii cells showed a difuse protein-plasma membrane association at acidic pH. At neutral pH the fluorescence pattern is showed as localized foci in plasma membrane and later, with extracellular alcalinization, it migrates into the cytosol. Thus, it can be inferred that this work gives some contribution to the development of new antifungal drugs, but still must undergo further production steps, proteolysis reduction and protein purification to allow structural and functional characterization of Rim8.
Keywords: Micoses sistêmicas
Drogas antifúngicas
Paracoccidioides spp
Alvo molecular Rim8
Produção de proteínas recombinantes
CNPq: CNPQ::CIENCIAS DA SAUDE
Language: por
Parents: Brasil
Publisher: Universidade Católica de Brasília
Institution Abbreviation: UCB
Department: Escola de Saúde e Medicina
Program: Programa Strictu Sensu em Ciências Genômicas e Biotecnologia
Citation: VIEIRA, Lucas Luiz. Expressão e purificação do alvo molecular Rim8 visando o desenvolvimento de novas drogas antifúngicas. 2016. 115 f. Dissertação (Programa Stricto Sensu em Ciências Genômicas e Biotecnologia) - Universidade Católica de Brasília, Brasília, 2016.
Access Type: Acesso Aberto
URI: https://bdtd.ucb.br:8443/jspui/handle/tede/2259
Document date: 14-Apr-2016
Appears in Collections:Programa de Pós-Graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
LucasLuizVieiraDissertacao2016.pdfDissertação2.65 MBAdobe PDFThumbnail

Download/Open Preview


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.