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Type: Dissertação
Title: Desenvolvimento de painéis multiplex de marcadores microssatélites para seleção assistida para qualidade de grãos de arroz (Oryza sativa L.)
Author(s): Lacerda, Thaísa Sant'anna 
First Advisor: Ferreira, Marcio Elias
???metadata.dc.contributor.referee1???: Pappas Júnior, Georgios Joannis
???metadata.dc.contributor.referee2???: Rangel, Paulo Hideo Nakano
Summary: O sucesso de uma variedade de arroz depende cada vez mais da qualidade dos seus grãos. A culinária brasileira exige, em geral, variedades com grãos longos, finos e alta qualidade de características físico-químicas, resultando em grãos mais soltos após a cocção. Qualidade de grãos é uma característica complexa, controlada por vários genes. O amido representa 90% do peso seco do grão beneficiado de arroz. A estrutura do amido é composta por dois tipos de polissacarídeos: amilose e amilopectina. Portanto, a composição de amilose e amilopectina no endosperma influencia diretamente a qualidade do grão de arroz. As enzimas da via metabólica de amido são codificadas por genes distribuídos em vários cromossomos, como os genes da ADP-glucose pirofosforilase, da sintase de amido, e das enzimas de ramificação e de desramificação de amido. Variação alélica nestes genes ou na região destes genes, em desequilíbrio de ligação com as sequências codantes que afetam a produção de amido pode, em tese, ser usada para selecionar indiretamente para o aumento da qualidade de grãos de arroz. Isto é importante porque a avaliação de qualidade de grãos em etapas iniciais do programa de melhoramento é, na prática, difícil de ser realizada. Os procedimentos de análise de qualidade de grãos (teor de amilose aparente, temperatura de gelatinização; coesividade, textura, etc.) demandam razoável quantidade de sementes, em geral não disponíveis nas primeiras gerações do programa de melhoramento. E mesmo na etapa final, quando a quantidade de sementes é suficiente, a fenotipagem para qualidade de grãos é complexa e intensiva em mão-de-obra. Portanto, a seleção indireta baseada em marcadores moleculares pode ter efeito significativo no melhoramento para qualidade de grãos se genótipos superiores puderem ser selecionadas nas etapas iniciais do programa. Este trabalho teve por objetivo desenvolver painéis de marcadores microssatélites situados na região de genes da via metabólica de amido para uso em seleção assistida para qualidade de grãos. O objetivo foi desenvolver painéis de marcadores microssatélites com as seguintes características: (1) capacidade de amplificação simultânea de alelos em quatro ou mais locos microssatélites ligados a genes da via metabólica de amido; (2) qualidade e repetibilidade dos produtos de PCR em análise de polimorfismo em seqüenciadores de DNA; (3) alto conteúdo informativo (PIC) e diversidade gênica esperada dos marcadores selecionados; (4) análise combinada de pelo menos uma dezena de locos da via metabólica de amido, ou seja, o conjunto de painéis multiplex deve possibilitar a análise indireta de polimorfismo de DNA na região de vários genes selecionados. Para isto, foram identificadas milhares de sequências microssatélites na região de 11 genes da via metabólica de amido. Nestas regiões genômicas foram selecionados dois microssatélites acima e dois abaixo de cada gene, a uma distância máxima 200 kpb da sequência codificante. Quarenta-e-quatro microssatélites, sendo quatro na região de cada um dos 11 genes, distribuídos em seis cromossomos, foram selecionados para análise. Iniciadores (primers) de PCR foram desenhados, sintetizados e testados para cada marcador. Deste total, trinta e quatro marcadores microssatélites foram selecionados para análise. Após testar diferentes combinações de marcadores para amplificação alélica simultânea, foram desenvolvidos três painéis multiplex (dois tetraplexes e um pentaplex), com capacidade de genotipagem de 11 locos microssatélites ligados a genes da via metabólica de amido. Um painel adicional com quatro marcadores, capaz de substituir na íntegra os marcadores de um dos tetraplexes, também foi desenvolvido. Cada painel possui pelo menos um loco em comum com os demais (SBE-IIa.H4), permitindo o controle de genotipagem entre painéis e minimizando a possibilidade de erro humano durante os ensaios. O PIC médio estimado dos locos selecionados foi 0,609, variando de 0,128 a 0,891, e a Probablilidade de Exclusão combinada dos painéis multiplexes selecionados foi de 0,9965-Painel J; 0,993-Painel K; 0,999 Painel L e 0,9992 Painel M. Os painéis multiplexes foram validados para seleção para qualidade de grãos de arroz através de mapeamento de QTLs de componentes de qualidade de grãos e através de testes independência entre fenótipo e genótipo em amostras de acessos do Banco de Germoplasma de Arroz tomadas ao acaso. O mapeamento de QTLs foi realizado em uma população de linhagens puras recombinantes (RIL) derivada do cruzamento entre as cultivares Chorinho e Amaroo. Cinco (AGPS2.C4, Waxy.F4,SBE-I.G3,SBE-IIb.I3, SSIIa.L2) dos 34 locos microssatélites desenvolvidos apresentaram segregação alélica nesta população. A população foi fenotipada para sete componentes de qualidade de grãos: Teor de Amilose (TA), Temperatura de Gelatinização (TG), Centro Branco (CB), Largura do Grão (LG), Comprimento do Grão (CG), Rendimento de Benefício (RB) e Rendimento de Grãos Inteiros (RI). Foram detectados QTLs de qualidade de grãos na região dos microssatélites Waxy.F4 (Teor de Amilose e Centro Branco) e SSIIa.L2 (Temperatura de Gelatinização) no cromossomo 6, e AGPS2.C4 (Largura do Grão) no cromossomo 8. Outros QTLs de componentes de qualidade de grãos foram detectados para Comprimento do Grão (cromossomo 7), Largura do Grão (cromossomos 2, 7 e 9) e Centro Branco (cromossomos 1 e 11). Uma amostra de 23 acessos do Banco de Germoplasma foi caracterizada para os sete componentes de qualidade de grãos já descritos e genotipada com os 34 marcadores microssatélites. Em testes de independência entre genótipo e fenótipo, os marcadores AGPS1.A1, AGPS1.A2, Dbe.Pul.E3, SBE-IIa.H2, SBE-IIa.H3 e SBE-IIb.I2 permitiram a identificação dos acessos do Banco de Germoplasma com mais do que 22% de Teor de Amilose com grande acurácia. Merece destaque o marcador SBE-IIb.I2, com uma eficiência de 82% na identificação de acessos com alto e baixo Teor de Amilose no Banco de Germoplasma. Todos os acessos com genótipo 154/154 no marcador AGPS1.A1 apresentaram Teor de Amilose menor do que 22%. Para Largura do Grão, grande parte dos acessos testados com o marcador Dbe.Pul.E3 possui um índice de Largura do Grão maior do que 5,0 (largo a extra-largo). Já o marcador AGPS2.C4 permitiu a identificação da maioria dos acessos de grãos finos e extra-finos, com índice Largura do Grão menor do que 5,0 (genótipo 184/184). Os dados de mapeamento de QTLs na população RIL Chorinho x Amaroo e de avaliação genética de amostras do Banco de Germoplasma de arroz permitem concluir que os marcadores microssatélites desenvolvidos na região dos genes AGPS1, AGPS2,DBE-Pullulanase, Waxy, SBE-IIa e SSIIa da via metabólica de amido são informativos para emprego em seleção assistida para qualidade de grãos de arroz.
Abstract: The success of a rice variety is increasingly dependent on the quality of its grain. The Brazilian cuisine requires, in general, varieties with high physical-chemical properties, with long and narrow grains, resulting in loose grains upon cooking. Grain quality is a complex trait controlled by several genes. Starch represents 90% of the grain dry weight. The structure of starch is composed by two types of polysaccharides: amylose and amylopectin. Therefore, the composition of amylose and amylopectin in the endosperm directly influences the quality of the rice grain. The enzymes of the starch pathwayare encoded by genes located in several chromosomes, such as the genes coding for ADP-glucose pyrophosphorylase, starch synthase and starch branching and debranching enzyme . It is expected that allelic variation in these genes or in the region in linkage disequilibrium with the coding sequences which affect the production of starch can, in theory, be used to indirectly select for grain quality. This is important because the assessment of grain quality in the initial stages of a breeding program is in practice difficult to achieve. Grain quality analysis (apparent amylose content, gelatinization temperature, cohesiveness, texture, etc.) requires a reasonable amount of seed, what generally is not available in earlier generations of a breeding program. Even in the final stage, when the amount of seed is higher, phenotyping for grain quality is a complex and labor intensive endeavour. Therefore, indirect selection based on molecular markers might have significant effect on breeding for grain quality if superior genotypes can be selected in the initial stages of the breeding program. The present study aimed to develop panels of microsatellite markers in the vicinity of starch pathway genes for use in assisted selection for grain quality. The objective was to develop panels of microsatellite markers with the following characteristics: (1) ability to simultaneous amplification of alleles at four or more microsatellite loci linked to genes of the starch pathway, (2) quality and repeatability of the PCR products for DNA polymorphism analysis, (3) high information content (PIC) and gene diversity expected of selected markers, (4) combined analysis of at least ten loci of the pathway of starch, which means that the set of multiplex panels should allow the indirect analysis of DNA polymorphism in the region of several selected starch pathway genes. For this, we identified thousands of microsatellite sequences in the vicinity of 11 genes of the starch pathway. Two microsatellite loci upstream and two downstream of a starch pathway coding gene were then selected, at a maximum distance of 200 kpb on each direction. Four microsatellites located in the flanking region of each of 11 starch patway genes, distributed among six chromosomes, were selected for analysis. PCR primers were designed, synthesized and tested for each of the 44 markers. Of this total, thirty-four microsatellite markers were finally selected for analysis. After testing different combinations of markers for simultaneous allele amplification, three multiplex panels (two with four markers e one with five markers) were developed, which are capable of genotyping 11 microsatellite loci linked to starch pathway genes. An additional panel with four markers, which can fully replace the panels with four markers, was also developed. All panels have at least one microsatellite marker (SBE-IIa.H4) in common, allowing for genotyping control, minimizing the possibility of human error during the PCR assays. The estimated average PIC value of the loci studied was 0.609, ranging from 0.128 to 0.891, and the combined Probability of Exclusion of the selected panels were 0.9965(Panel J); 0.993(Panel K), 0.999 (Panel L) and 0.9992 (Panel M). The multiplex panels have been validated for selection for grain quality of rice by QTL mapping of grain quality traits and through genotype and phenotype independence tests based on random accessions of the Rice Germplasm Bank. QTL mapping was performed in a population of recombinant inbred lines (RIL) derived from the cross between the cultivars Chorinho and Amaroo. Five (AGPS2.C4, Waxy.F4, SBE-I.G3, SBE-IIb.I3, SSIIa.L2) of 34 microsatellite loci selected showed allelic segregation in this population. The population was phenotyped for seven traits: Amylose Content (TA), Gelatinization Gemperature (TG), White Center (CB), Grain Width (LG), Grain Length (CG), Grain Milling (RB), Whole Grain Milling and Grain Yield (RI). QTLs were detected for grain quality in the region of the microsatellites Waxy.F4 (Amylose Content and White Center) and SSIIa.L2 (Gelatinization Gemperature) on chromosome 6, and AGPS2.C4 (Grain Width) on chromosome 8. QTLs for other traits were detected in other genome regions, such as Grain Length (chromosome 7), Grain Width (chromosomes 2, 7 and 9) and White Center (chromosomes 1 and 11). A sample of 23 accessions of of the Rice Germplasm Bank was analised for the seven traits described above and genotyped with the 34 microsatellite markers. Independence tests using the markers AGPS1.A1, AGPS1.A2, Dbe.Pul.E3, SBE-IIa.H2, SBE-SBE-IIa.H3 and IIb.I2 allowed the identification of accessions of the Germplasm Bank with more than 22% of Amylose Content with great accuracy. Also noteworthy is the marker SBE-IIb.I2, with an efficiency of 82% in the identification of accessions with high and low Amylose Content in the gene bank. On locus AGPS1.A1, all accessions with the 154/154 marker genotype presented less than 22% of amylose contente. Most of the accessions tested with the marker Dbe.Pul.E3 had a Grain Width index greater than 5.0 (large to extra large grain). Marker AGPS2.C4 allowed the identification of most narrow and extra-thin grain accessions, with an index lower than 5.0 (genotype 184/184). The QTL mapping data of the RIL population Chorinho x Amaroo and the genetic evaluation of samples of the Rice Germplasm Bank suggest that the microsatellite markers developed in the region of the starch pathway genes AGPS1, AGPS2, DBE-pullulanase, Waxy, SBE-IIa and SSIIa are informative for use in assisted selection for grain quality of rice
Keywords: microssatélite
qualidade de grãos
teor de amilose
seleção assistida
temperatura de gelatinização
Microssatelite
Grain Quality
Amylose Content
Gelatinization temperature
Marker Assisted Slection
Starch
arroz - cultivos agrícolas; arroz - melhoramento genético; bioteconologia agrícola - amido
CNPq: CNPQ::OUTROS
Language: por
Parents: BR
Publisher: Universidade Católica de Brasília
Institution Abbreviation: UCB
Department: Direito
Program: Programa de Pós-Graduação em Direito
Citation: LACERDA, Thaísa Sant'anna. Desenvolvimento de painéis multiplex de marcadores microssatélites para seleção assistida para qualidade de grãos de arroz (Oryza sativa L.). 2009. 283 f. Dissertação (Mestrado em Direito) - Universidade Católica de Brasília, Brasília, 2009.
Access Type: Acesso Aberto
URI:  https://bdtd.ucb.br:8443/jspui/handle/123456789/410
Document date: 18-Aug-2009
Appears in Collections:Programa de Pós-Graduação em Direito

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